diff --git a/.gitignore b/.gitignore index a789340..eb23da1 100644 --- a/.gitignore +++ b/.gitignore @@ -167,3 +167,7 @@ work/ *fastq.gz *fq.gz .nf-test + +output/* +results/* +trace* \ No newline at end of file diff --git a/README.md b/README.md index 914252a..9beda4b 100644 --- a/README.md +++ b/README.md @@ -11,15 +11,14 @@ In this repo they are included in `./test_data/ref_data`. ## Running the Nextflow -Workflow takes 2 parameters: +Workflow takes several parameters, one of which is likely specified by the user: - input_dir. folder containing input fastq files. -- ref_files. folder containing reference files To save output files need to set `--publish_dir` which will save output files to directory provided. example: ``` -nextflow run . -profile local --publish_dir results --input_dir test_data/successful --ref_files test_data/ref_data/ +nextflow run . -profile local --publish_dir results --input_dir test_data/successful ``` Change `input_dir` to point to your files. Will look for files based on default parameter: @@ -27,6 +26,21 @@ Change `input_dir` to point to your files. Will look for files based on default params.input_paired_suffix = "*_{1,2}.fastq.gz" ``` +These parameters are set by default in the `nextflow.config` file: + +``` +reference_genomes_dir = 'data/knowledge/reference_genomes/' # Path to reference genomes +reference_genome_suffix = '_genomic.fna.gz' # Suffix of reference genome files +accession = 'GCA_000195955.2' # Reference genome accession to be used in run +reference = 'Mycobacterium tuberculosis' # Reference genome name to be used in run +``` + +For this configuration, the pipeline will require a file at this path relative to the run dir: + +``` +data/knowledge/reference_genomes/GCA_000195955.2_genomic.fna.gz +``` + ## The Pipeline - Run clockwork to assemble a genome - second process summarises some of the process to a report file diff --git a/main.nf b/main.nf index 0984d94..b37c267 100644 --- a/main.nf +++ b/main.nf @@ -17,8 +17,8 @@ workflow { Parameters: ------------------------------------------------------------------------ - --input_dir Directory holding the fastq files *reads{1,2}.fq.gz - --ref_files Location of the reference genome pre prepared files + --input_dir Directory holding the fastq files *reads{1,2}.fq.gz + --ref_fasta_gzip Location of the reference genome """.stripIndent() ) exit(0) @@ -34,7 +34,6 @@ workflow { Parameters: ------------------------------------------------------------------------ --input_dir ${params.input_dir} - --ref_files ${params.ref_files} Runtime data: ------------------------------------------------------------------------ @@ -47,34 +46,72 @@ workflow { read_ch = Channel.fromFilePairs("${params.input_dir}/${params.input_paired_suffix}", checkIfExists: true) .ifEmpty { error("cannot find any reads matching ${params.input_paired_suffix} in ${params.input_dir}") } - ref_files = Channel.fromPath(params.ref_files).first() + read_ch = read_ch.map { it -> + [ + it[0], + it[1], + params.reference, + params.accession, + file(params.reference_genomes_dir + params.accession + params.reference_genome_suffix), + ] + } read_ch.take(3).view() - clockwork(read_ch, ref_files) + clockwork(read_ch) } + workflow clockwork { take: reads - ref_files main: + // Set up input channels + ref_name_ch = reads.map { it -> [it[0], it[2]] } + ref_fasta_gzip_ch = reads.map { it -> [it[0], it[4]] } + + // Prepare reference data for Clockwork based on FASTA file + ref_dir_ch = reads.map { it -> [it[0], it[1]] }.join(prepare_clockwork_reference(reads).ref_dir) + + // Run variant calling and assembly + clockwork_ch = run_clockwork(ref_dir_ch) - run_clockwork(reads, ref_files) - calc_counts(run_clockwork.out.final_gvcf.join(run_clockwork.out.final_fasta), "${moduleDir}/tb_clockwork_report.json.template", ref_files) + // Calculate counts and generate report + calc_counts_ch = calc_counts(clockwork_ch.final_gvcf.join(clockwork_ch.final_fasta).join(ref_fasta_gzip_ch), "${moduleDir}/tb_clockwork_report.json.template") emit: - cortex_vcf = run_clockwork.out.cortex_vcf - final_gvcf = run_clockwork.out.final_gvcf - final_gvcf_decompressed = run_clockwork.out.final_gvcf_decompressed - final_fasta = run_clockwork.out.final_fasta - final_vcf = run_clockwork.out.final_vcf - samtools_vcf = run_clockwork.out.samtools_vcf - map_bam = run_clockwork.out.map_bam - map_bam_bai = run_clockwork.out.map_bam_bai - tb_clockwork_report_json = calc_counts.out.tb_clockwork_report_json - tb_clockwork_error_json = run_clockwork.out.tb_clockwork_error_json + cortex_vcf = clockwork_ch.cortex_vcf.join(ref_name_ch) + final_gvcf = clockwork_ch.final_gvcf.join(ref_name_ch) + final_gvcf_decompressed = clockwork_ch.final_gvcf_decompressed.join(ref_name_ch) + final_fasta = clockwork_ch.final_fasta.join(ref_name_ch) + final_vcf = clockwork_ch.final_vcf.join(ref_name_ch) + samtools_vcf = clockwork_ch.samtools_vcf.join(ref_name_ch) + map_bam = clockwork_ch.map_bam.join(ref_name_ch) + map_bam_bai = clockwork_ch.map_bam_bai.join(ref_name_ch) + tb_clockwork_report_json = calc_counts_ch.tb_clockwork_report_json.join(ref_name_ch) + tb_clockwork_error_json = clockwork_ch.tb_clockwork_error_json.join(ref_name_ch) +} + +process prepare_clockwork_reference { + publishDir "${params.publish_dir}", enabled: params.publish_dir != "", mode: "copy", saveAs: { filename -> sample_name + "_" + filename } + container params.container_prefix + "/gpas/clockwork:v0.12.5" + cpus 2 + memory { 16.GB * task.attempt } + pod label: "name", value: "clockwork_pipeline:prepare_clockwork_reference" + pod label: "sample_id", value: "${params.sample_id}" + pod label: "run_id", value: "${params.run_id}" + + input: + tuple val(sample_name), path(reads), val(reference), val(accession), path(ref_fasta_gzip) + + output: + tuple val(sample_name), path("ref_dir"), emit: ref_dir + + script: + """ + clockwork reference_prepare --outdir ref_dir ${ref_fasta_gzip} + """ } process run_clockwork { @@ -87,8 +124,7 @@ process run_clockwork { pod label: "run_id", value: "${params.run_id}" input: - tuple val(sample_name), path(reads) - path ref_files + tuple val(sample_name), path(reads), path("ref_dir") output: tuple val(sample_name), path("${outdir}/alternate-cortex.vcf.gz"), emit: cortex_vcf @@ -104,7 +140,7 @@ process run_clockwork { script: outdir = "outdir" """ - clockwork variant_call_one_sample --keep_bam --filter_min_dp 3 --fasta_min_dp 3 --no_trim ${ref_files} ${outdir} ${reads[0]} ${reads[1]} + clockwork variant_call_one_sample --keep_bam --filter_min_dp 3 --fasta_min_dp 3 --no_trim ref_dir ${outdir} ${reads[0]} ${reads[1]} if [ ! -f "${outdir}/cortex.vcf" ]; then echo -e "##fileformat=VCFv4.2\n#CHROM\tPOS\tID\tREF\tALT\tQUAL\tFILTER\tINFO\tFORMAT\tsample" > ${outdir}/cortex.vcf fi @@ -121,8 +157,8 @@ process run_clockwork { gzip ${outdir}/alternate-cortex.vcf gzip ${outdir}/alternate-samtools.vcf - # replace header of fasta file - sed -i "1s/^>.*/>${sample_name} ref=NC_000962.3/" ${outdir}/final.fasta + # tidy header of fasta file + sed -i -e "s/^>/>${sample_name} ref=/" -e "s/\\.sample//g" ${outdir}/final.fasta """ } @@ -136,9 +172,8 @@ process calc_counts { pod label: "run_id", value: "${params.run_id}" input: - tuple val(sample_name), path(gvcf_file), path(fasta_file) + tuple val(sample_name), path(gvcf_file), path(fasta_file), path(ref_fasta_gzip) path report_template - path ref_files output: tuple val(sample_name), path("genome_creation_report.json"), emit: tb_clockwork_report_json @@ -156,7 +191,9 @@ process calc_counts { export null_calls=\$(cat ${fasta_file} | grep -v "^>" | grep -o N | wc -l ) - export reference_genome_length=\$(cat ${ref_files}/ref.fa | grep -v "^>" | tr -d '\\n' | wc -c ) + gunzip -c ${ref_fasta_gzip} > ref.fa + + export reference_genome_length=\$(cat ref.fa | grep -v "^>" | tr -d '\\n' | wc -c ) echo "Het Count: \$het_count" echo "Fixed coverage: \$fixed_coverage" diff --git a/nextflow.config b/nextflow.config index 19ae7b6..a0901be 100644 --- a/nextflow.config +++ b/nextflow.config @@ -4,6 +4,10 @@ params { testing = "" help = "" publish_dir = "" + reference_genome_suffix = '.fa.gz' + reference_genomes_dir = 'test_data/ref_data/' + accession = 'NC_000962.3' + reference = 'Mycobacterium tuberculosis' } profiles { @@ -16,7 +20,9 @@ profiles { fixOwnership = true } env.WORKSPACE = 'offline' - params.container_prefix = 'lhr.ocir.io/lrbvkel2wjot' + params { + container_prefix = 'lhr.ocir.io/lrbvkel2wjot' + } } testing { diff --git a/test_data/ref_data/NC_000962.3.fa.gz b/test_data/ref_data/NC_000962.3.fa.gz new file mode 100644 index 0000000..768ec00 Binary files /dev/null and b/test_data/ref_data/NC_000962.3.fa.gz differ diff --git a/test_data/ref_data/ref.fa b/test_data/ref_data/ref.fa deleted file mode 100644 index db9501b..0000000 --- a/test_data/ref_data/ref.fa +++ /dev/null @@ -1,73527 +0,0 @@ ->NC_000962.3 -TTGACCGATGACCCCGGTTCAGGCTTCACCACAGTGTGGAACGCGGTCGTCTCCGAACTT -AACGGCGACCCTAAGGTTGACGACGGACCCAGCAGTGATGCTAATCTCAGCGCTCCGCTG -ACCCCTCAGCAAAGGGCTTGGCTCAATCTCGTCCAGCCATTGACCATCGTCGAGGGGTTT -GCTCTGTTATCCGTGCCGAGCAGCTTTGTCCAAAACGAAATCGAGCGCCATCTGCGGGCC -CCGATTACCGACGCTCTCAGCCGCCGACTCGGACATCAGATCCAACTCGGGGTCCGCATC -GCTCCGCCGGCGACCGACGAAGCCGACGACACTACCGTGCCGCCTTCCGAAAATCCTGCT -ACCACATCGCCAGACACCACAACCGACAACGACGAGATTGATGACAGCGCTGCGGCACGG -GGCGATAACCAGCACAGTTGGCCAAGTTACTTCACCGAGCGCCCGCACAATACCGATTCC -GCTACCGCTGGCGTAACCAGCCTTAACCGTCGCTACACCTTTGATACGTTCGTTATCGGC -GCCTCCAACCGGTTCGCGCACGCCGCCGCCTTGGCGATCGCAGAAGCACCCGCCCGCGCT -TACAACCCCCTGTTCATCTGGGGCGAGTCCGGTCTCGGCAAGACACACCTGCTACACGCG -GCAGGCAACTATGCCCAACGGTTGTTCCCGGGAATGCGGGTCAAATATGTCTCCACCGAG -GAATTCACCAACGACTTCATTAACTCGCTCCGCGATGACCGCAAGGTCGCATTCAAACGC -AGCTACCGCGACGTAGACGTGCTGTTGGTCGACGACATCCAATTCATTGAAGGCAAAGAG -GGTATTCAAGAGGAGTTCTTCCACACCTTCAACACCTTGCACAATGCCAACAAGCAAATC -GTCATCTCATCTGACCGCCCACCCAAGCAGCTCGCCACCCTCGAGGACCGGCTGAGAACC -CGCTTTGAGTGGGGGCTGATCACTGACGTACAACCACCCGAGCTGGAGACCCGCATCGCC -ATCTTGCGCAAGAAAGCACAGATGGAACGGCTCGCGGTCCCCGACGATGTCCTCGAACTC -ATCGCCAGCAGTATCGAACGCAATATCCGTGAACTCGAGGGCGCGCTGATCCGGGTCACC -GCGTTCGCCTCATTGAACAAAACACCAATCGACAAAGCGCTGGCCGAGATTGTGCTTCGC -GATCTGATCGCCGACGCCAACACCATGCAAATCAGCGCGGCGACGATCATGGCTGCCACC -GCCGAATACTTCGACACTACCGTCGAAGAGCTTCGCGGGCCCGGCAAGACCCGAGCACTG -GCCCAGTCACGACAGATTGCGATGTACCTGTGTCGTGAGCTCACCGATCTTTCGTTGCCC -AAAATCGGCCAAGCGTTCGGCCGTGATCACACAACCGTCATGTACGCCCAACGCAAGATC -CTGTCCGAGATGGCCGAGCGCCGTGAGGTCTTTGATCACGTCAAAGAACTCACCACTCGC -ATCCGTCAGCGCTCCAAGCGCTAGCACGGCGTGTTCTTCCGACAACGTTCTTAAAAAAAC -TTCTCTCTCCCAGGTCACACCAGTCACAGAGATTGGCTGTGAGTGTCGCTGTGCACAAAC -CGCGCACAGACTCATACAGTCCCGGCGGTTCCGTTCACAACCCACGCCTCATCCCCACCG -ACCCAACACACACCCCACAGTCATCGCCACCGTCATCCACAACTCCGACCGACGTCGACC -TGCACCAAGACCAGACTGTCCCCAAACTGCACACCCTCTAATACTGTTACCGAGATTTCT -TCGTCGTTTGTTCTTGGAAAGACAGCGCTGGGGATCGTTCGCTGGATACCACCCGCATAA -CTGGCTCGTCGCGGTGGGTCAGAGGTCAATGATGAACTTTCAAGTTGACGTGAGAAGCTC -TACGGTTGTTGTTCGACTGCTGTTGCGGCCGTCGTGGCGGGTCACGCGTCATGGGCATTC -GTCGTTGGCAGTCCCCACGCTAGCGGGGCGCTAGCCACGGGATCGAACTCATCGTGAGGT -GAAAGGGCGCAATGGACGCGGCTACGACAAGAGTTGGCCTCACCGACTTGACGTTTCGTT -TGCTACGAGAGTCTTTCGCCGATGCGGTGTCGTGGGTGGCTAAAAATCTGCCAGCCAGGC -CCGCGGTGCCGGTGCTCTCCGGCGTGTTGTTGACCGGCTCGGACAACGGTCTGACGATTT -CCGGATTCGACTACGAGGTTTCCGCCGAGGCCCAGGTTGGCGCTGAAATTGTTTCTCCTG -GAAGCGTTTTAGTTTCTGGCCGATTGTTGTCCGATATTACCCGGGCGTTGCCTAACAAGC -CCGTAGACGTTCATGTCGAAGGTAACCGGGTCGCATTGACCTGCGGTAACGCCAGGTTTT -CGCTACCGACGATGCCAGTCGAGGATTATCCGACGCTGCCGACGCTGCCGGAAGAGACCG -GATTGTTGCCTGCGGAATTATTCGCCGAGGCAATCAGTCAGGTCGCTATCGCCGCCGGCC -GGGACGACACGTTGCCTATGTTGACCGGCATCCGGGTCGAAATCCTCGGTGAGACGGTGG -TTTTGGCCGCTACCGACAGGTTTCGCCTGGCTGTTCGAGAACTGAAGTGGTCGGCGTCGT -CGCCAGATATCGAAGCGGCTGTGCTGGTCCCGGCCAAGACGCTGGCCGAGGCCGCCAAAG -CGGGCATCGGCGGCTCTGACGTTCGTTTGTCGTTGGGTACTGGGCCGGGGGTGGGCAAGG -ATGGCCTGCTCGGTATCAGTGGGAACGGCAAGCGCAGCACCACGCGACTTCTTGATGCCG -AGTTCCCGAAGTTTCGGCAGTTGCTACCAACCGAACACACCGCGGTGGCCACCATGGACG -TGGCCGAGTTGATCGAAGCGATCAAGCTGGTTGCGTTGGTAGCTGATCGGGGCGCGCAGG -TGCGCATGGAGTTCGCTGATGGCAGCGTGCGGCTTTCTGCGGGTGCCGATGATGTTGGAC -GAGCCGAGGAAGATCTTGTTGTTGACTATGCCGGTGAACCATTGACGATTGCGTTTAACC -CAACCTATCTAACGGACGGTTTGAGTTCGTTGCGCTCGGAGCGAGTGTCTTTCGGGTTTA -CGACTGCGGGTAAGCCTGCCTTGCTACGTCCGGTGTCCGGGGACGATCGCCCTGTGGCGG -GTCTGAATGGCAACGGTCCGTTCCCGGCGGTGTCGACGGACTATGTCTATCTGTTGATGC -CGGTTCGGTTGCCGGGCTGAGCACTTGGCGCCCGGGTAGGTGTACGTCCGTCATTTGGGG -CTGCGTGACTTCCGGTCCTGGGCATGTGTAGATCTGGAATTGCATCCAGGGCGGACGGTT -TTTGTTGGGCCTAACGGTTATGGTAAGACGAATCTTATTGAGGCACTGTGGTATTCGACG -ACGTTAGGTTCGCACCGCGTTAGCGCCGATTTGCCGTTGATCCGGGTAGGTACCGATCGT -GCGGTGATCTCCACGATCGTGGTGAACGACGGTAGAGAATGTGCCGTCGACCTCGAGATC -GCCACGGGGCGAGTCAACAAAGCGCGATTGAATCGATCATCGGTCCGAAGTACACGTGAT -GTGGTCGGAGTGCTTCGAGCTGTGTTGTTTGCCCCTGAGGATCTGGGGTTGGTTCGTGGG -GATCCCGCTGACCGGCGGCGCTATCTGGATGATCTGGCGATCGTGCGTAGGCCTGCGATC -GCTGCGGTACGAGCCGAATATGAGAGGGTGTTGCGCCAGCGGACGGCGTTATTGAAGTCC -GTACCTGGAGCACGGTATCGGGGTGACCGGGGTGTGTTTGACACTCTTGAGGTATGGGAC -AGTCGTTTGGCGGAGCACGGGGCTGAACTGGTGGCCGCCCGCATCGATTTGGTCAACCAG -TTGGCACCGGAAGTGAAGAAGGCATACCAGCTGTTGGCGCCGGAATCGCGATCGGCGTCT -ATCGGTTATCGGGCCAGCATGGATGTAACCGGTCCCAGCGAGCAGTCAGATATCGATCGG -CAATTGTTAGCAGCTCGGCTGTTGGCGGCGCTGGCGGCCCGTCGGGATGCCGAACTCGAG -CGTGGGGTTTGTCTAGTTGGTCCGCACCGTGACGACCTAATACTGCGACTAGGCGATCAA -CCCGCGAAAGGATTTGCTAGCCATGGGGAGGCGTGGTCGTTGGCGGTGGCACTGCGGTTG -GCGGCCTATCAACTGTTACGCGTTGATGGTGGTGAGCCGGTGTTGTTGCTCGACGACGTG -TTCGCCGAACTGGATGTCATGCGCCGTCGAGCGTTGGCGACGGCGGCCGAGTCCGCCGAA -CAGGTGTTGGTGACTGCCGCGGTGCTCGAGGATATTCCCGCCGGCTGGGACGCCAGGCGG -GTGCACATCGATGTGCGTGCCGATGACACCGGATCGATGTCGGTGGTTCTGCCATGACGG -GTTCTGTTGACCGGCCCGACCAGAATCGCGGTGAGCGATCAATGAAGTCACCAGGGTTGG -ATTTGGTCAGGCGCACCCTGGACGAAGCTCGTGCTGCTGCCCGCGCGCGCGGACAAGACG -CCGGTCGAGGGCGGGTCGCTTCCGTTGCGTCGGGTCGGGTGGCCGGACGGCGACGAAGCT -GGTCGGGTCCGGGGCCCGACATTCGTGATCCACAACCGCTGGGTAAGGCCGCTCGTGAGC -TGGCAAAGAAACGCGGCTGGTCGGTGCGGGTCGCCGAGGGTATGGTGCTCGGCCAGTGGT -CTGCGGTGGTCGGCCACCAGATCGCCGAACATGCACGCCCGACTGCGCTAAACGACGGGG -TGTTGAGCGTGATTGCGGAGTCGACGGCGTGGGCGACGCAGTTGAGGATCATGCAGGCCC -AGCTTCTGGCCAAGATCGCCGCAGCGGTTGGCAACGATGTGGTGCGATCGCTAAAGATCA -CCGGGCCGGCGGCACCATCGTGGCGCAAGGGGCCTCGCCATATTGCCGGTAGGGGTCCGC -GCGACACCTACGGATAACACGTCGATCGGCCCAGAACAAGGCGCTCCGGTCCCGGCCTGA -GAGCCTCGAGGACGAAGCGGATCCGTATGCCGGACGTCGGGACGCACCAGGAAGAAAGAT -GTCCGACGCACGGCGCGGTTAGATGGGTAAAAACGAGGCCAGAAGATCGGCCCTGGCGCC -CGATCACGGTACAGTGGTGTGCGACCCCCTGCGGCGACTCAACCGCATGCACGCAACCCC -TGAGGAGAGTATTCGGATCGTGGCTGCCCAGAAAAAGAAGGCCCAAGACGAATACGGCGC -TGCGTCTATCACCATTCTCGAAGGGCTGGAGGCCGTCCGCAAACGTCCCGGCATGTACAT -TGGCTCGACCGGTGAGCGCGGTTTACACCATCTCATTTGGGAGGTGGTCGACAACGCGGT -CGACGAGGCGATGGCCGGTTATGCAACCACAGTGAACGTAGTGCTGCTTGAGGATGGCGG -TGTCGAGGTCGCCGACGACGGCCGCGGCATTCCGGTCGCCACCCACGCCTCCGGCATACC -GACCGTCGACGTGGTGATGACACAACTACATGCCGGCGGCAAGTTCGACTCGGACGCGTA -TGCGATATCTGGTGGTCTGCACGGCGTCGGCGTGTCGGTGGTTAACGCGCTATCCACCCG -GCTCGAAGTCGAGATCAAGCGCGACGGGTACGAGTGGTCTCAGGTTTATGAGAAGTCGGA -ACCCCTGGGCCTCAAGCAAGGGGCGCCGACCAAGAAGACGGGGTCAACGGTGCGGTTCTG -GGCCGACCCCGCTGTTTTCGAAACCACGGAATACGACTTCGAAACCGTCGCCCGCCGGCT -GCAAGAGATGGCGTTCCTCAACAAGGGGCTGACCATCAACCTGACCGACGAGAGGGTGAC -CCAAGACGAGGTCGTCGACGAAGTGGTCAGCGACGTCGCCGAGGCGCCGAAGTCGGCAAG -TGAACGCGCAGCCGAATCCACTGCACCGCACAAAGTTAAGAGCCGCACCTTTCACTATCC -GGGTGGCCTGGTGGACTTCGTGAAACACATCAACCGCACCAAGAACGCGATTCATAGCAG -CATCGTGGACTTTTCCGGCAAGGGCACCGGGCACGAGGTGGAGATCGCGATGCAATGGAA -CGCCGGGTATTCGGAGTCGGTGCACACCTTCGCCAACACCATCAACACCCACGAGGGCGG -CACCCACGAAGAGGGCTTCCGCAGCGCGCTGACGTCGGTGGTGAACAAGTACGCCAAGGA -CCGCAAGCTACTGAAGGACAAGGACCCCAACCTCACCGGTGACGATATCCGGGAAGGCCT -GGCCGCTGTGATCTCGGTGAAGGTCAGCGAACCGCAGTTCGAGGGCCAGACCAAGACCAA -GTTGGGCAACACCGAGGTCAAATCGTTTGTGCAGAAGGTCTGTAACGAACAGCTGACCCA -CTGGTTTGAAGCCAACCCCACCGACGCGAAAGTCGTTGTGAACAAGGCTGTGTCCTCGGC -GCAAGCCCGTATCGCGGCACGTAAGGCACGAGAGTTGGTGCGGCGTAAGAGCGCCACCGA -CATCGGTGGATTGCCCGGCAAGCTGGCCGATTGCCGTTCCACGGATCCGCGCAAGTCCGA -ACTGTATGTCGTAGAAGGTGACTCGGCCGGCGGTTCTGCAAAAAGCGGTCGCGATTCGAT -GTTCCAGGCGATACTTCCGCTGCGCGGCAAGATCATCAATGTGGAGAAAGCGCGCATCGA -CCGGGTGCTAAAGAACACCGAAGTTCAGGCGATCATCACGGCGCTGGGCACCGGGATCCA -CGACGAGTTCGATATCGGCAAGCTGCGCTACCACAAGATCGTGCTGATGGCCGACGCCGA -TGTTGACGGCCAACATATTTCCACGCTGTTGTTGACGTTGTTGTTCCGGTTCATGCGGCC -GCTCATCGAGAACGGGCATGTGTTTTTGGCACAACCGCCGCTGTACAAACTCAAGTGGCA -GCGCAGTGACCCGGAATTCGCATACTCCGACCGCGAGCGCGACGGTCTGCTGGAGGCGGG -GCTGAAGGCCGGGAAGAAGATCAACAAGGAAGACGGCATTCAGCGGTACAAGGGTCTAGG -TGAAATGGACGCTAAGGAGTTGTGGGAGACCACCATGGATCCCTCGGTTCGTGTGTTGCG -TCAAGTGACGCTGGACGACGCCGCCGCCGCCGACGAGTTGTTCTCCATCCTGATGGGCGA -GGACGTCGACGCGCGGCGCAGCTTTATCACCCGCAACGCCAAGGATGTTCGGTTCCTGGA -TGTCTAACGCAACCCTGCGTTCGATTGCAAACGAGGAATAGATGACAGACACGACGTTGC -CGCCTGACGACTCGCTCGACCGGATCGAACCGGTTGACATCGAGCAGGAGATGCAGCGCA -GCTACATCGACTATGCGATGAGCGTGATCGTCGGCCGCGCGCTGCCGGAGGTGCGCGACG -GGCTCAAGCCCGTGCATCGCCGGGTGCTCTATGCAATGTTCGATTCCGGCTTCCGCCCGG -ACCGCAGCCACGCCAAGTCGGCCCGGTCGGTTGCCGAGACCATGGGCAACTACCACCCGC -ACGGCGACGCGTCGATCTACGACAGCCTGGTGCGCATGGCCCAGCCCTGGTCGCTGCGCT -ACCCGCTGGTGGACGGCCAGGGCAACTTCGGCTCGCCAGGCAATGACCCACCGGCGGCGA -TGAGGTACACCGAAGCCCGGCTGACCCCGTTGGCGATGGAGATGCTGAGGGAAATCGACG -AGGAGACAGTCGATTTCATCCCTAACTACGACGGCCGGGTGCAAGAGCCGACGGTGCTAC -CCAGCCGGTTCCCCAACCTGCTGGCCAACGGGTCAGGCGGCATCGCGGTCGGCATGGCAA -CCAATATCCCGCCGCACAACCTGCGTGAGCTGGCCGACGCGGTGTTCTGGGCGCTGGAGA -ATCACGACGCCGACGAAGAGGAGACCCTGGCCGCGGTCATGGGGCGGGTTAAAGGCCCGG -ACTTCCCGACCGCCGGACTGATCGTCGGATCCCAGGGCACCGCTGATGCCTACAAAACTG -GCCGCGGCTCCATTCGAATGCGCGGAGTTGTTGAGGTAGAAGAGGATTCCCGCGGTCGTA -CCTCGCTGGTGATCACCGAGTTGCCGTATCAGGTCAACCACGACAACTTCATCACTTCGA -TCGCCGAACAGGTCCGAGACGGCAAGCTGGCCGGCATTTCCAACATTGAGGACCAGTCTA -GCGATCGGGTCGGTTTACGCATCGTCATCGAGATCAAGCGCGATGCGGTGGCCAAGGTGG -TGATCAATAACCTTTACAAGCACACCCAGCTGCAGACCAGCTTTGGCGCCAACATGCTAG -CGATCGTCGACGGGGTGCCGCGCACGCTGCGGCTGGACCAGCTGATCCGCTATTACGTTG -ACCACCAACTCGACGTCATTGTGCGGCGCACCACCTACCGGCTGCGCAAGGCAAACGAGC -GAGCCCACATTCTGCGCGGCCTGGTTAAAGCGCTCGACGCGCTGGACGAGGTCATTGCAC -TGATCCGGGCGTCGGAGACCGTCGATATCGCCCGGGCCGGACTGATCGAGCTGCTCGACA -TCGACGAGATCCAGGCCCAGGCAATCCTGGACATGCAGTTGCGGCGCCTGGCCGCACTGG -AACGCCAGCGCATCATCGACGACCTGGCCAAAATCGAGGCCGAGATCGCCGATCTGGAAG -ACATCCTGGCAAAACCCGAGCGGCAGCGTGGGATCGTGCGCGACGAACTCGCCGAAATCG -TGGACAGGCACGGCGACGACCGGCGTACCCGGATCATCGCGGCCGACGGAGACGTCAGCG -ACGAGGATTTGATCGCCCGCGAGGACGTCGTTGTCACTATCACCGAAACGGGATACGCCA -AGCGCACCAAGACCGATCTGTATCGCAGCCAGAAACGCGGCGGCAAGGGCGTGCAGGGTG -CGGGGTTGAAGCAGGACGACATCGTCGCGCACTTCTTCGTGTGCTCCACCCACGATTTGA -TCCTGTTCTTCACCACCCAGGGACGGGTTTATCGGGCCAAGGCCTACGACTTGCCCGAGG -CCTCCCGGACGGCGCGCGGGCAGCACGTGGCCAACCTGTTAGCCTTCCAGCCCGAGGAAC -GCATCGCCCAGGTCATCCAGATTCGCGGCTACACCGACGCCCCGTACCTGGTGCTGGCCA -CTCGCAACGGGCTGGTGAAAAAGTCCAAGCTGACCGACTTCGACTCCAATCGCTCGGGCG -GAATCGTGGCGGTCAACCTGCGCGACAACGACGAGCTGGTCGGTGCGGTGCTGTGTTCGG -CCGGCGACGACCTGCTGCTGGTCTCGGCCAACGGGCAGTCCATCAGGTTCTCGGCGACCG -ACGAGGCGCTGCGGCCAATGGGTCGTGCCACCTCGGGTGTGCAGGGCATGCGGTTCAATA -TCGACGACCGGCTGCTGTCGCTGAACGTCGTGCGTGAAGGCACCTATCTGCTGGTGGCGA -CGTCAGGGGGCTATGCGAAACGTACCGCGATCGAGGAATACCCGGTACAGGGCCGCGGCG -GTAAAGGTGTGCTGACGGTCATGTACGACCGCCGGCGCGGCAGGTTGGTTGGGGCGTTGA -TTGTCGACGACGACAGCGAGCTGTATGCCGTCACTTCCGGCGGTGGCGTGATCCGCACCG -CGGCACGCCAGGTTCGCAAGGCGGGACGGCAGACCAAGGGTGTTCGGTTGATGAATCTGG -GCGAGGGCGACACACTGTTGGCCATCGCGCGCAACGCCGAAGAAAGTGGCGACGATAATG -CCGTGGACGCCAACGGCGCAGACCAGACGGGCAATTAATCAGGCTCGCCCGACGACGATG -CGGATCGCGTAGCGATCTGAGGAGGAATCGGGCAGCTAGGCTCGGCAGCCGGGTACGAGT -GTTAGGAGTCGGGGTGACTGCACCGAACGAGCCGGGGGCGCTCAGCAAGGGCGACGGCCC -GAATGCGGATGGCTTGGTCGACCGTGGGGGCGCACATCGGGCAGCGACCGGGCCAGGCCG -CATACCAGATGCTGGAGACCCGCCGCCGTGGCAGCGTGCTGCGACTCGGCAATCCCAAGC -GGGGCATCGTCAGCCGCCGCCGGTATCACACCCTGAGGGGCGCCCGACCAACCCGCCCGC -CGCCGCCGATGCTCGGCTGAATCGCTTCATCTCCGGTGCGTCTGCCCCGGTGACCGGCCC -AGCCGCCGCGGTCAGGACCCCGCAGCCGGATCCCGACGCTTCGCTGGGGTGTGGCGACGG -TTCCCCCGCCGAGGCCTATGCCAGCGAGCTGCCCGACCTATCCGGCCCGACTCCGCGGGC -CCCGCAACGCAACCCCGCGCCGGCGCGTCCCGCGGAGGGTGGCGCGGGATCGAGAGGGGA -TTCGGCCGCCGGTTCGAGCGGCGGTCGTTCGATTACCGCTGAGAGTAGAGACGCCCGTGT -CCAGCTGTCGGCGCGGCGAAGCCGCGGGCCGGTTCGAGCCAGCATGCAGATCCGACGGAT -TGATCCATGGAGCACGTTGAAGGTGTCGCTGTTGTTGTCGGTGGCGCTGTTCTTCGTCTG -GATGATCACGGTCGCGTTCCTCTACCTGGTGCTCGGCGGTATGGGCGTATGGGCCAAGCT -CAACAGCAACGTCGGTGACCTGTTGAACAACGCGAGCGGCAGCAGCGCGGAACTTGTCTC -CAGCGGCACCATCTTCGGCGGCGCATTCCTGATCGGCTTGGTCAACATCGTCCTGATGAC 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